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7種細胞凋亡有效的檢測方法

更新時間:2020-08-21      點擊次數(shù):1553

7種細胞凋亡有效的檢測方法

一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 

根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征,人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。

1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

3 透射電子顯微鏡觀察

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè),但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面,暴露在細胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

 三、線粒體膜勢能的檢測 

線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用,多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細胞發(fā)生凋亡,而線粒體跨膜電位的下降,被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中早發(fā)生的事件,它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前,一旦線粒體DYmt崩潰,則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

線粒體跨膜電位的存在,使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì),其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。

四、DNA的片斷化檢測 

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經(jīng)處理后,采用常規(guī)方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少,還可在分離提純DNA后,用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。

 1.大分子染色體DNA的片段的測定

2.DNA Ladder 測定

3.凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析

 五、TUNEL法 

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能反應(yīng)細胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定,并可檢測出極少量的凋亡細胞,因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

 六、Caspase-3活性的檢測 

Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著重要的作用,其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子,它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中,在凋亡的早期階段,它被激活,活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成,裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物,導(dǎo)致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞,caspase-3的活性明顯下降。

 七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析 

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